小麦叶锈病是由小麦叶锈菌引起的一种气传性真菌病害，是危害小麦生产最重要的病害之一。利用小麦基因池中的遗传抗性培育抗病品种是控制叶锈病最为可持续的方法。多个抗性基因聚合是获得持久，广谱抗性品种的重要策略。瑞士冬小麦品种Forno自1980s推广种植以来对所有测试的小麦叶锈菌生理小种表现近免疫水平抗性。遗传分析发现，Forno的抗性受多基因控制，含有成株期抗病（adult plant resistance，APR）基因Lr34和Lr75，以及小种专化型的全生育期抗病（all-stage resistance，ASR）基因Lr14a。1967年，McIntosh等首次报道了Lr14a基因，表现为不完全显性遗传（在部分遗传背景下表现显性遗传），抗性表现依赖于遗传背景和环境。
Lr14a最初来自于四倍体Yaroslav 野生二粒小麦，在1930年McFadden将其导入到六倍体面包小麦基因池中。之后培育了第一个含有Lr14a的面包小麦品种Hope，Hope同时携带有抗秆锈基因Sr2，作为重要亲本材料被广泛的用于多个杂交育种项目。Herrera-Foessel等将Lr14a定位在7B染色体上，该位点与小麦白粉病、秆锈病抗性连锁。有趣的是，Lr14a的抗性被至少四个位点修饰，分别位于7A, 7B和7D，这些位点增强或者抑制Lr14a的抗性，其中一些特定的组合会使Lr14a完全失去抗性。
近日，瑞士苏黎世大学Beat Keller和沙特阿拉伯阿卜杜拉国王科技大学Simon G. Krattinger团队利用MutChromSeq结合VIGS技术克隆了具叶锈病抗性基因Lr14a。该研究以“A membrane-bound ankyrin repeat protein confers race-specific leaf rust disease resistance in wheat”为题发表在国际权威学术期刊Nature Communications上。
Lr14a序列全长2340bp，包含3个外显子，编码一个膜定位蛋白（ANK-TM）， 779个氨基酸，在N端含有一个12个锚蛋白（ANK）重复结构和6个预测的跨膜（TM）螺旋结构，与Ca2+通道蛋白具有高度的结构相似性。Ca2+是植物中激素调控、生物和非生物胁迫响应等多个信号传递的第二信使。接种Lr14a近等基因系材料Thatcher和ThatcherLr14a进行RNAseq试验，差异表达分析结果表明Lr14a响应的抗性反应与钙离子信号通路有关。将Lr14a转入本氏烟叶片，与空载对照比较有26个显著富集的基因与钙离子结合相关，进一步证明Lr14a与钙离子信号通路相关。Lr14a侵染烟草会产生叶片浸水表型，而EMS功能缺失突变体的Lr14a序列不能引起同样的表型，说明LR14A直接或间接的诱导质膜钙离子流的改变，从而造成渗透平衡被打破，引发叶片浸水表型。氯化镧（LaCl3）是一种钙离子通道阻滞剂，可以抑制钙离子进入细胞。用氯化镧处理叶片可以解除这种浸水表型，表明Lr14a介导的抗性与钙离子流的改变相关。该项研究结果为ANK-TM蛋白在抗病育种中的应用提供了基础。具体内容如下：
1.EMS突变体+VIGS基因沉默技术确定Lr14a编码基因
ArinaLrFor作为野生型创制了7个独立的EMS突变体，其中3个突变体用于7B染色体分离进行MutChromSeq测序，测序结果与ArinaLrFor基因组序列比对，获得了一个只包含1个基因的contig， 3个突变体的基因序列与WT之间的SNP突变位点相互独立。剩余的4个突变体也分别表现非同义SNP突变。利用Vigs技术沉默该基因后，植株会变得更加感病。初步判定该基因为Lr14a，序列全长2340bp，包含3个外显子，编码一个膜定位蛋白（ANK-TM）， 779个氨基酸，在N端含有一个12个锚蛋白（ANK）重复结构和6个预测的跨膜（TM）螺旋结构（图1）。ANK重复存在于古细菌，细菌，病毒，真核生物。ANK重复结构域由30个含有30个氨基酸的motif组成，形成两个α螺旋。ANK-重复结构单独存在或者与TM结构域，钙结合结构域，锌指结构域，钾离子通道结构域等结合存在，与植物免疫，发育，生长，蛋白互作有关。
图1Lr14a编码一个ANK-TM蛋白
2.Lr14a的表型依赖于基因型和环境
利用Lr14a的DNA序列，在第一个外显子区开发了Lr14a的单显性诊断标记。标记在双亲定位群体中与Lr14a表现完全的共分离。另外Hope, Kalyansona, 和Selkirk等之前被认为含有Lr14a位点的小麦品种分子检测均表现阳性，进一步证明ANK-TM 就是Lr14a（图2 a，b）。
在双亲群体中含有Lr14a的家系表现广泛的中间体抗性反应，不同比例的过敏斑和叶锈孢子。在含有Lr14a的小麦品种中也表现不同的抗性差异。这可能是由于Lr14a的遗传修饰子（genetic modifiers）的结果。这种强烈的变异与数量抗性基因类似。另外,Lr14a的抗性被认为对温度敏感，在低温环境下会表现出更好的抗性（图2c）。
图2Lr14a的标记分析，作图和表型变异
3.小种特异诱导Lr14a的表达
在接种无毒生理小种96209后两天，Lr14a表达增加，而在未接种的植株中表达量非常低或者检测不到，大约在接种后4天表达量最高，之后开始减少（图3a）。在感病突变体中的Lr14a的表达量相对ArinaLrFor更低（图3b）。Lr14a的转录水平与病程相关基因（PR）的诱导有关。ArinaLrFor苗期接种无毒生理小种与不接种的植株Lr14a表现类似低水平的表达。在这些植株中，PR1与PR2基因与不接种的植株比较表现高表达,而PR5在这两种条件下均低表达（图3c），说明PR5的诱导可能依赖于Lr14a的特异机制。这些结果表明Lr14a基因属于小种专化型抗性。
图3 在不同条件下Lr14a与病程相关marker基因的相对表达
4.Lr14a在草本植物基因池中高度保守
利用Lr14a诊断标记共鉴定到27份面包小麦种质，7份spelt，41份四倍体，8份野生二粒小麦含有Lr14a基因，这83份材料的Lr14a编码序列与ArinaLrFor完全一致，说明Lr14a在草本植物基因池中具有高度保守性。另外Lr14a呈阳性的Spelt系对无毒小种不表现抗性反应，但是有3个阳性Spelt小麦与感病面包小麦Arina杂交的F1植株表现强烈的苗期抗性，进一步证明了Lr14a修饰子的存在。
分析小麦10+Genome数据，发现Lr14a基因在Lancer和Spelt 种质PI190962中存在，它们与ArinaLrFor基因组共同含有一个64.1Kb的片段。分子钟表明Lancer与ArinaLrFor 单倍型的分化发生在大约44000年前，Spelt单倍型分化于大约8000-12000年前。与ArinaLrFor相比较，中国春上含有一个大约315Kb的缺失片段（包含Lr14a位点），这个315Kb被一个10-50Kb长的串联重复包含，Lr14a可能是在不平等交换中丢失了，导致共线性完全被打断，形成强烈的单倍型多样性（图4）。两个单倍型与ArinaLrFor相似，但与Lr14a匹配，说明多个类Lr14a单倍型被独立的导入到面包小麦种质。
图4 小麦品种ArinaLrFor和中国春在Lr14a位点的序列比较
5. ANK-TM 蛋白LR14A 可能作为Ca2+ 通道参与抗性反应
ANK-TM基因家族在玉米，水稻，拟南芥中分别包含15,37,40个成员。在拟南芥和玉米中，LR14A蛋白同系物被证明参与病害和胁迫响应，拟南芥中的Accelerated Cell Death 6（ACD6）是一个植物生长发育和病原菌防御的关键调控子，突变体acd6植株获得广谱抗病性。与acd6相反，Lr14a表现小种专化抗性，对植物的生长活力没有负效应，这可能是在没有病原菌侵染时，Lr14a不表达的结果。ACD6定位在质膜上，LR14A的N端在本氏烟中过表达试验将LR14A同样定位在质膜上（图5）。ACD6的抗病性与SA水平有关，但是接种的ArinaLrFor和EMS突变植株之间的SA水平没有差异，说明LR14A的抗性可能与ACD6不同，与SA的水平无关。
图5 LR14A定位与质膜
有趣的是，发现LR14A与钙离子通道具有高度的结构相似性，而钙离子是植物中激素调控、生物和非生物胁迫响应等多个信号传递的第二信使。接种Thatcher和ThatcherLr14a进行RNAseq试验，8dpi时有7986个差异表达基因，其中160个显著差异表达基因与钙离子结合相关。未接种的ThatcherLr14a与mock之间只分别有65与193个差异表达基因，其中只分别有2和1个与钙离子结合相关。将Lr14a打入本氏烟叶片中，与空载对照比较有26个显著富集的基因与钙离子结合相关。Lr14a在小麦和烟草中的表达分析结果均表型Lr14a响应的抗性反应与钙离子信号通路有关（图 6a，b）。
Lr14a侵染烟草会产生叶片浸水表型，而EMS功能缺失突变体的Lr14a序列不能引起同样的表型，说明LR14A直接或间接的诱导质膜钙离子流的改变，从而造成渗透平衡被打破，引发叶片浸水表型。氯化镧（LaCl3）是一种钙离子通道阻滞剂，可以抑制钙离子进入细胞。用氯化镧处理叶片可以解除这种浸水表型，表明Lr14a介导的抗性与钙离子流的改变相关（图 6c，d，e）。
图6 LR14A在小麦和本氏烟中诱导Ca2+粒子结合相关基因
6. 多个ANK-TM蛋白可能参与小麦小种专化抗病性
ANK-TM蛋白通过与PRRs，NLRs，或者质膜钙离子通道相互作用参与抗病反应。LR14A可能与AvrLR14A直接或者间接互作,其中ANK 结构域可能直接作为病原菌效应因子的靶标。近期克隆的小麦条锈病抗性基因YrU1编码一个含有ANK结构域的NLR蛋白。YrU1的ANK结构域起源于ANK-TM蛋白，可能作为病原菌效应因子的诱饵存在（图7）。这些结果说明存在多个ANK-TM蛋白可能参与小麦小种专化抗病性，为这种蛋白在抗病育种中的应用提供了基础。
图7 LR14A同系物的比较和系统发育分析